Опыт одиночного цикла размножения

Все стороны инфекционного процесса наиболее удобно изучать при одиночном цикле размножения по Эллису и Дельбрюку (1939). При этом удается определить минимальный латентный период внутриклеточного размножения фага и средний выход («урожай») фага. Латентный период определяется как минимальный период времени между адсорбцией фаха на клетке - хозяине и ее лизисом с освобождением фагового потомства. Выход фага представляет собой средний «урожай» фаговых частиц на одну инфицированную бактерию. Оба эти показателя можно определять и другими методами, но опыт одиночного цикла размножения дает возможность определить их одновременно. Методика определения следующая:

1. Фаг и бактерии смешивают в концентрациях, допускающих быструю адсорбцию.

2. После соответствующего периода адсорбции смесь разводят антифаговой сывороткой для прекращения адсорбции и инактивации неадсорбированного фага.

3. После периода, достаточного для действия антител, смесь вновь разводят в питательной среде с таким расчетом, чтобы в каждой пробе содержалось около 100 инфицированных бактерий.

4. Из суспензий инфицированных бактерий периодически (до момента завершения лизиса) берут пробы и каждую пробу испытывают методом подсчета стерильных пятен.

Если посев на чашку произведен до начала лизиса, каждая инфицированная бактерия образует одно стерильное пятно. Если лизис предшествует посеву на чашку, то из каждой бактерии освобождается значительное число фаговых частиц, и каждая такая частица вызывает образование стерильного пятна. Поэтому число пятен, образующихся при посеве взятых в последовательном порядке проб, остается постоянным до тех пор, пока не закончится латентный период и не начнется лизис. С этого момента число пятен в каждой последующей пробе возрастает до тех пор, пока не наступит лизис всех инфицированных бактерий, после чего число их становится постоянным. Разделив конечное число освободившихся фаговых частиц на начальное число инфицированных бактерий, получим средний выход фага.

Разведение смеси по окончании периода адсорбции — необходимый этап эксперимента, так как оно предупреждает дальнейшую адсорбцию. Если суспензию инфицированных бактерий не разводить, то многие фаговые частицы, освободившиеся из ранее лизировавшихся бактерий, адсорбируются вновь на еще не подвергшихся лизису особях и начнут второй инфекционный цикл. Антитела инактивируют неадсорбировавшийся фаг, не влияя на размножение адсорбировавшегося (Дельбрюк, 1945). Если же оставить неадсорбировавшийся фаг неинактивированным, то при подсчетах окажется больше стерильных пятен и величина выхода фага будет занижена.

Эти детали метода одиночного цикла размножения приведены потому, что не все работающие с фагом понимают их значение. Метод позволяет легко и просто определить влияние изменений физических и химических условий среды на продолжительность инфекционного - цикла и выход вируса на одну инфицированную клетку - хозяина.

~1~ ~2~ ~3~ ~4~ ~5~ ~6~ ~7~ ~8~ ~9~ ~10~ ~11~ ~12~ ~13~ ~14~ ~15~