Серологические исследования

Постановка реакции связывания комплемента при сапе

Реакция производится в водяной бане в общем объеме 2,5 мл всех .компонентов при температуре 37—38°С.

Компоненты реакции:
а) гемолизин — рабочий титр не менее 1 : 1 000;
б) сапной антиген — экстракт сапного микроба;
в) свежая или консервированная сыворотка морской свинки (комплемент);
г) испытуемая сыворотка и сыворотки (нормальная и сапная) для титрации комплемента в бактериологической системе, инактивированные в день постановки реакции при температуре 58—59°С в течение 30 минут;
д) 2,5% взвесь эритроцитов от осадка на физиологическом растворе (1 : 40);
е) физиологический раствор (0,85% раствор химически чистой поваренной соли в дистиллированной воде);

Примечание. Гемолизин и сапной антиген изготовляются централизованно на биофабриках.

Титрация компонентов реакции

Перед реакцией производится титрация, гемолизина, и комплемента в гемолитической системе и комплемента в бактериологической системе.

а) Титрация гемолизина

При титрации гемолизина делаются следующие разведения: 1 : 100 (основное разведение) , 1 : 500, 1 : 1 000, 1 : 1 500, 1 : 2 000, 1 : 2 500, 1 : 3 000, 1 : 3 500, 1 : 4 000 и т. д.

Примечание. В случае, если гемолизин консервирован карболовой кислотой, то берется 0,1 гемолизина на 9,9 физраствора, (1 : 100), если же он консервирован глицерином, то следует брать 0,2 гемолизина на 9,8 физраствора (обычно гемолизин консервируют глицерином).

Комплемент употребляется в разведении 1 : 20 по 0,5 и эритроциты 2,5% взвесь из осадка — по 0,5. Взамен сапного антигена и сыворотки лошади в пробирки прибавляется 1 мл физиологического раствора. Время течения реакции — 10 минут в водяной бане при температуре 37—38°С. Титр гемолизина — наименьшее количество его, потребное для полного гемолиза 0,5 мл взвеси эритроцитов при комплементе 0,5 разведения 1 : 20 при температуре 37—38°С в течение 10 минут. Рабочей дозой гемолизина для дальнейших титраций комплемента и сапного антигена, а также для реакции при испытании подозрительных по сапу сывороток (главного опыта)) считается удвоенный титр гемолизина.

При титрации гемолизина ставятся следующие контроли:

1) контроль гемолизина (т. е. гемолизин 1 : 100 + эритроциты физраствор до объема 2,5 при отсутствии комплемента);

2) комплемента (т. е. комплемент + эритроциты + физраствор до объема 2,5 при отсутствии гемолизина) и

3) физраствора (т. е. эритроциты + физраствор до объема 2,5 при отсутствии гемолизина и комплемента). Во всех контрольных пробирках гемолиз эритроците отсутствует. Для дальнейшей работы допускается, смешивание гемолизина и эритроцитов в одинаковых объемах.

б) Титрация комплемента в гемолитической системе

Комплемент исследуется в следующих дозах: 0,1; 0,13; 0,16; 0,19; 0,22 и т. д. с интервалами по 0,03 до 0,49 комплемента разведения 1 :20 (см. схему). В каждую пробирку до недостающего количества - (объема) 0,5 мл доливать физраствор (1-я пробирка физраствора 0,4; вторая — 0,37 и т. д.).

Титром комплемента в гемолитических системах считается наименьшее количество, потребное для полного гемолиза 0,5 мл взвеси эритроцитов при вытитрованной дозе гемолизина в течение 10 минут в водяной бане при температуре 37—38°C.

в) Титрация комплемента в бактериологической системе

Компоненты: сапные сыворотки ++++ и ++, консервированные 5% карболово-физиологическим раствором (на 9 мл сыворотки 1 мл раствора) нормальные сыворотки — две. Сыворотки берутся той же давности, что и испытуемые.
Сапные к нормальные сыворотки наливаются в пробирку по 0,05-0,45 физраствора (или делается разведение 1 : 10 и разливается по пробиркам по 0,5). Разведение комплемента из основного разведения (1:20) начинается на 2 интервала ниже против титра его в гемолитической системе; если титр комплемента в гемолитической системе 0,25, то разведение начинаемся с 0,19; 0,22; 0,25; 0,28 и т. д. Каждое разведение комплемента ставится с контролем без антигена. Во все пробирки до недостающей 0,5; дозы комплемента добавляют физраствор.

После разливки нормальных и сапных сывороток, сапного антигена в титре и соответствующих доз комплемента пробирки для связывания ставятся на 20 минут в водяную баню при 37°С, после чего в них разливается по 0,5 мл гемолизина в рабочем титре и 0,5 мл эритроцитов барана (2,5% взвесь). Время реакции в гемолитической системе — 20 минут.

Титр комплемента — минимальное количество его, потребное для полного гемолиза взвеси эритроцитов в пробирках с нормальными, сыворотками с антигеном и без антигена, а также в пробирках с сапными сыворотками без антигена, при соответствующей задержке гемолиза в сапной сыворотке с антигеном при температуре 37°С в течение 20 минут.

Разведение комплемента для главного опыта

Требуется произвести исследование 100 пробирок. Титр комплемента в бактериологической системе 0,3 с разведением 1 : 20. Следовательно, в каждой пробирке чистого комплемента имеется 0,015, т. е. 0,3 : 20 = 0,015.

Т.е. 0,015X100 = 1,5 чистого комплемента и 48,5 физраствора.

Примечание. Антиген применяется в титре, установленном биофабрикой; при получении новой партии титр его проверяется на известных сапных и нормальных сыворотках.

Испытуемые сыворотки исследуются в дозе 0,05. Контроли без антигена в дозе 0,1. Инактивируются сыворотки с физраствором при 58—59°С 30 минут. Время связывания бактериологической системы в бане — 20 минут, реакция — 20 минут.

Сыворотки, обнаружившие ту или иную степень задержки гемолиза, проверяются вторично в дозах 0,1 и 0,05 с контролем в дозе ОД; при массовых исследованиях допускается первую реакцию производить с сывороткой без контроля (сыворотки без антигена).

Основные контроли глазного опыта:

1. Нормальные и сапные сыворотки с антигеном и без антигена, в дозах 0,05.
2. Антиген в двойной дозе без сыворотки.
3. Контроли гемолитической системы.

Оценка результатов реакции

Официальной диагностической дозой сыворотки, по которой дается результат, является 0,05 для реакции, производящейся в объеме 0,5 мл. Доза 0,1 является вспомогательно-контрольной. Результат реакции оценивается два раза: первый раз тотчас после бани, второй — через 12 часов стояния проб при комнатной температуре. Результат реакции выражается крестами:

а) положительная реакция ++++, +++, ++±
б) сомнительная реакция ++, +
в) отрицательная реакция -

Степени задержки, выражаемые крестами, соответствуют следующим процентам гемолиза эритроцитов:

++++ гемолиза эритроцитов от 0 до 10%
+++ гемолиза эритроцитов от 10 до 40%
++± гемолиза эритроцитов от 40 до 50%
++ гемолиза эритроцитов от 50 до 70%
+ гемолиза эритроцитов от 70 до 90%
- гемолиза эритроцитов от 90 до 100%

Результат исследования сообщается словами: положительная, сомнительная, отрицательная с указанием крестов.

Данные всех титрационных опытов и особенностей реакции вносятся в дневник серологических работ лаборатории.
Для внесения объективного признака в определение результата реакции крестами и однообразной оценки ее в различных лабораториях рекомендуется оценку производить в процентах гемолиза. Это производится следующим образом: из реакции выбирается 5 пробирок с полным гемолизом, и жидкость сливается в одну пробирку. Эта жидкость равняется 100% гемолиза. Из нее приготовляются разведения с меньшими процентами гемолиза следующим образом:

Оценка результатов реакции

Стандартные пробирки приготовляются перед учетом реакции. Учет производится тогда, когда эритроцитыосели на дно пробирки, сравниваются с цветом находящейся над осадком жидкости в стандартной пробирке и процент переводится в кресты.
Примечание. Для более наглядного сопоставления реакции со стандартной жидкостью гемолиза рекомендуется при изготовлении этого стандарта, не изменяя объема жидкости, в каждую пробирку добавлять кровяных шариков барана в разведении 1 : 40 по следующей схеме:

Оценка результатов реакции

Титрация сапного антигена

Для титрации берутся две сапные сыворотки различной активности (++++ и ++) и одна нормальная сыворотка Сапные сыворотки предварительно разводятся следующим образом:

1,0 сыворотки +9,0 физраствора = разведению 1:10
0,4 сыворотки +9,60 физраствора = разведению 1:25
0,20 сыворотки +9,80 физраствора = разведению 1:50
0,13 сыворотки +9,87 физраствора = разведению 1:75
0,1 сыворотки +9,9 физраствора = разведению 1:100

Комплемент, гемолизин и эритроциты — в рабочих титрах, температура ванны и время обычные.

Схема реакции следующая:

Оценка результатов реакции

По этой схеме ставятся и остальные разведения сыворотки. Нормальная сыворотка берется в первом и втором разведениях. Контроль на антиген — пробирка с антигеном без сыворотки.

Оценка результатов реакции

Наибольшая задержка гемолиза в сильно разведенных бруцеллезных сыворотках произошла с разведением антигена 1 : 150. Это разведение и является рабочим титром антигена.

Титром антигена считается то разведение его, которое дает наибольшую задержку гемолиза с разведенными сапными сыворотками разной активности.
Примечание. Антиген должен быть прозрачным. Результаты титрации заносятся подробно в лабораторную книгу.

Примерный результат реакции. Определение производится в процентах гемолиза и по осадку эритроцитов:

-1-  -2-  -3-  -4-  -5-  -6-  -7-  -8-  -9-  -10-  -11-  -12-  -13-  -14-  -15-  -16-  -17-  -18-  -19-  -20-  -21-  -22-  -23-  -24-  -25-  -26-  -27-  -28-  -29-  -30-  -31-  -32-  -33-  -34-  -35-